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在上一篇文章《正確認識小肽產品》 中 ，除了分享現有蛋白質原料的優缺點之外，也介紹了小肽的營養價值及相關資訊，接著我們要來介紹該如何測量小肽產品中小肽的含量。

目前飼料用小肽產品的檢測方是大致如下：

壹．關於小肽產品中小肽含量的確定：

1．1 檢測方法：三氯乙酸氮溶指數（TCA—NSI）
1．2 原理：三氯乙酸是一種蛋白質沈澱劑，它可以沈澱蛋白質和較長的肽段。隨著酶解反應的進行，蛋白質的肽鏈逐漸被切成大小不等的片段，三氯乙酸氮溶指數提高。因此，三氯乙酸氮溶指數可以準確地反應蛋白質的酶解情況，溶解指數越高，表明小肽的含量越高。
1．3 方法：肽含量檢測方法—三氯乙酸氮溶指數（TCA-NSI）

一、儀器設備

1. 實驗室用樣品粉碎機或研缽

2. 分析篩：孔徑0.45mm（40目）

3. 分析天平：感量0.0001g   

4. 煮爐或電爐   

5. 滴定管：酸式，10、25mL   

6.  消煮管：250mL   

7. 凱氏燒瓶：250mL   

8. 離心管   

9. 凱氏蒸餾裝置：半微量凱氏定氮裝置   

10.  錐形瓶：150、250mL   

11．容量瓶：100mL   

12. 燒杯：250 mL     

13. 臺式離心機：定時，調速，轉速可達4000 轉/分   

14. 普通磁力攪拌器 

15. 移液管：25 mL    

16. 稱樣皿

17. 電熱式恆溫烘箱：可控制溫度為105±2 ℃

二、試劑

1. 硫酸：化學純，含量為98％，無氮；

2. 混合催化劑：0.4g 五水硫酸銅，6g硫酸鉀，均為化學純，磨碎混勻；

3. 氫氧化鈉：化學純，40％水溶液（m/V）；

4. 硼酸（GB 628）：化學純，4％水溶液（m/V）；

5. 混合指示劑：甲基紅0.1％乙醇溶液，溴甲酚綠0.5％乙醇溶液，兩溶液等體積混合；

6. 鹽酸標準溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標定，按GB 601製備；鹽酸標準溶液：C（HCl）=0.02mol/L。1.67mL鹽酸（GB622，分析純），注入1000mL蒸餾水中

7. 硫酸銨：分析純，乾燥；

8. 三氯乙酸：分析純，10％水溶液（m/V）。

9. 蔗糖（HG3-1001）：分析純

三、操作方法

1. 取稱樣皿一隻， 250mL燒杯一隻，離心試管六隻，洗淨後置於烘箱中備用。

2. 粉碎研磨，全部過40目篩，取篩下物約5克置於稱樣皿中，在105℃的溫度下烘乾3h，取出，蓋好稱樣皿蓋，在乾燥器中冷卻30min，稱重。再同樣烘乾1h, 冷卻，稱重，直至兩次重量之差小於0.002g為恆重。

3. 稱取恆重後的樣品m1克（註：樣品約2至3克），置於燒杯中，加蒸餾水75mL，室溫下電磁攪拌45分鐘。將燒杯中溶液及沈澱搖勻，折入離心試管中，離心後收集上清液（1號上清液）。
註：離心轉速2500轉/分鐘，離心時間10分鐘。

4. 取1號上清液25mL，加入25mL10%的三氯乙酸溶液，混合後靜置20分鐘。將燒杯中溶液及沈澱搖勻，折入離心試管中，離心後收集上清液（2號上清液）。
註：離心轉速4000轉/分鐘，離心時間20分鐘。

5. 取2號上清液25mL，小心移入乾燥的500mL凱氏燒瓶中，加入混合催化劑6.4g，再加入12mL濃硫酸和數粒玻璃珠，搖勻，將凱氏燒瓶置於電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化、泡沫消失後，再加強火力，直至呈透明的藍綠色，然後繼續加熱，至少2h.。待試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉人100mL容量瓶中，冷卻後用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。安裝好半微量蒸餾裝置後， 向接收瓶內加入20mL硼酸吸收液及2滴混合指示劑，並使冷凝管下端插入吸收液內，蒸汽發生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸。準確移取試樣分解液10mL注人蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加入密封，防止漏氣。蒸餾5min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然後停止蒸餾。

6. 蒸餾後的吸收液立即用0.02mol/L鹽酸標準溶液滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。得消耗鹽酸標液V1（mL），滴定的結果用空白實驗校正。

7. 另稱取樣品m2克（約0.5至1克），用步驟5相同的方法定氮，得消耗鹽酸標液V2（mL），滴定的結果用空白實驗校正。

四、計算公式

1. TCA-NSI（%）=（（V₁-V₀）×m₂×75）/（（V₂-V₀）×m₁×12.5） ×100 ……(1)1．三氯乙酸氮溶指數（TCA-NSI）按式（1）計算：

式中：m₁—測定可溶性氮時稱取的試樣質量，g;

m2—測定總氮時稱取的試樣質量，g;

V0—空白試驗消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，mL;

V1—測定可溶性氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，mL;

V2—測定總氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積，mL;

2. 允許誤差
每個試樣取兩平行樣進行測定，以算術平均值為結果。兩次平行測定結果絕對差值不大於3%。

1．4 富力肽中小肽含量的確定：採用上述方法進行檢測，可以確定產品中的小肽含量。例如在某產品中的全部蛋白類物質中小肽的含量為≧65%。在某產品中的水溶性蛋白類物質中小肽的含量為≧98%。 

貳、關於富力肽產品中小肽分子量譜的確定：

2．1 檢測方法：基質輔助鐳射解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF-Mass Spectroscopy）
2．2 原理：質譜是肽和蛋白質分析的重要工具，這主要歸功於一些軟電離技術的應用，其中最具代表性的即基質輔助鐳射解吸附電離（MALDI）。該項技術由於方便、靈敏度高，已成為蛋白質酶解產物中肽段質量譜分析（Peptide Mass Fingerprinting）的最有效的工具。MALDI-TOF-MS採用有紫外吸收的小分子晶體為基質，將待測物與基質結合。然後用一定波長的鐳射照射，聚集的能量加熱晶體，使基質晶體昇華而將非揮發性的待測物釋放到氣相中。MALDI主要生成待測物的單電荷離子，送入TOF（Time of Flight）分析儀，測得離子從起始譜到探測端的飛行時間，根據飛行時間的長短確定分子量的大小，從而得到一張完整的蛋白質酶解產物的肽段分子量圖譜。
2．3 富力肽產品中小肽分子量的確定：MALDI—TOF—MS的檢測結果表明，在某產品中的水溶性蛋白類物質中，富含2~6個胺基酸的小肽。

肽段的分子量區間為：
分子量（Dalton;道爾頓） 摩爾百分含量
0~160                        3%   
161~650                    87%   
651~1000                  8%    
> 1000                       2%